A. Τι είναι η Λειτουργική Γονιδιωματική
Λειτουργική Γονιδιωματική ονομάζουμε τον επιστημονικό κλάδο ο οποίος χρησιμοποιεί διαφορετικές τεχνικές της γενετικής, της μοριακής βιολογίας και της βιοπληροφορικής με σκοπό [1]:
- Να βρει την αλληλουχία
- Να κάνει την συναρμολόγηση και
- Να αναλύσει τη δομή και τη λειτουργία των γονιδιωμάτων. Δηλαδή ολόκληρης της γενετικής πληροφορίας που περιέχεται σε ένα κύτταρο ενός οργανισμού
Η αποκρυπτογράφηση της πρωταρχικής αλληλουχίας του DNA και η ταυτοποίηση χιλιάδων γονιδίων με ακόλουθη κατανόηση της δομικής και λειτουργικής οργάνωσης του ανθρώπινου γονιδιώματος έχουν ανοίξει δρόμους για νέες ευκαιρίες στην ανακάλυψη αιτιολογίας εμφάνισης και της παθογένεσης των μονογονιδιακών και πολυπαραγοντικών ασθενειών.
Υπάρχουν πολλές υποδιαιρέσεις της γονιδιωματικής, κυρίως όσον αφορά τις διαφορετικές τεχνικές που είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν κάθε φορά [6, 19].
Για παράδειγμα, η δομική γονιδιωματική ασχολείται με το μαζικό προσδιορισμό τρισδιάστατων δομών πρωτεϊνών από ολόκληρα γονιδιώματα, ενώ η λειτουργική γονιδιωματική ασχολείται με τη μελέτη των λειτουργικών περιοχών στα γονιδιώματα (υποκινητές μικρά RNA όπως miRNA, siRNA, κ.λπ.), καθώς επίσης χρησιμοποιεί τα τεράστια δεδομένα που παράγονται από το γονιδίωμα και τα αντίγραφά τους και από τους μεταβολίτες τους (όπως η αλληλουχία του γονιδιώματος, η αλληλουχία RNA, SNPs, metabolomics κ.α.) [2, 3, 4, 5, 6, 19].
Η Λειτουργική Γονιδιωματική, με βάση τα δεδομένα της γενετικής μοναδικότητας κάθε ατόμου, έχει ξεκινήσει τη μελέτη στη φαρμακογενετική, αναλύοντας τις αιτίες των χαμηλών ή αντιθέτως αυξημένων ευαισθησιών των ατόμων ή των μεμονωμένων πληθυσμών στις επιδράσεις των διαφόρων φαρμάκων ή χημικών ουσιών [7-13, 19]
Στη φαρμακογονιδιωματική αναπτύσσονται θεμέλια για την εξατομικευμένη θεραπεία και για τη δημιουργία νέων φαρμάκων που δρουν στοχευμένα σε ξεχωριστά μονοπάτια της παθολογικής διαδικασίας [10, 14, 15, 19].
Επικεντρώνεται στις δυναμικές πτυχές όπως η μεταγραφή των γονιδίων, η μετάφραση, η ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων και οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, σε αντίθεση με τις στατικές πτυχές των γονιδιωματικών πληροφοριών όπως η ακολουθία ή οι δομές DNA (Εικόνα 1) [6].
Εικόνα 1. There are several specific functional genomics approaches depending on what we are focused on (EMBL-EBI, https://www.ebi.ac.uk/training )
Η Λειτουργική Γονιδιωματική επίσης προσπαθεί να ποσοτικοποιήσει τις διαφορές στις βιολογικές διεργασίες και έτσι να βελτιώσει την κατανόησή μας για τις λειτουργίες και τις αλληλεπιδράσεις γονιδίων, των πρωτεϊνών και των μεταβολιτών τους, που τελικά διαμορφώνουν τον εκάστοτε φαινότυπο (παθολογικό, παθοφυσιολογικό ή φυσιολογικό).
Η Λειτουργική Γονιδιωματική επιτρέπει την ανίχνευση της ατομικής ποικιλομορφίας και επιτρέπει την ταυτοποίηση κάθε ατόμου με εξειδίκευση 100%. Επιτρέπει επίσης την ανίχνευση της ενδο-ατομικής μεταβλητότητας, ενώ για το ίδιο άτομο μπορεί να ποικίλει ανάλογα με την φυσιολογική κατάσταση, την αναπτυξιακή ή παθολογική κατάσταση των κυττάρων, των ιστών, των οργάνων ή ολόκληρου του οργανισμού.
Μέσω της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι εφικτό να δοθεί μια εξήγηση σε θέματα όπως: γιατί κάποιος αισθάνεται κόπωση (ενώ δεν έχει έντονη ζωή και παράλληλα έχει πλήρη γεύματα) ή να διευκρινιστεί σε κάποιον υπάρχει η τάση για φλεγμονές η μικροφλεγμονές κ.α.
Ο στόχος της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι να καθοριστεί πώς τα μεμονωμένα συστατικά ενός βιολογικού συστήματος συνεργάζονται για την παραγωγή ενός συγκεκριμένου φαινοτύπου.
Η λειτουργική γονιδιωματική επικεντρώνεται στη δυναμική έκφραση των γονιδιακών προϊόντων σε ένα συγκεκριμένο πλαίσιο, για παράδειγμα, σε ένα συγκεκριμένο στάδιο ανάπτυξης ή κατά τη διάρκεια μιας ασθένειας.
Στη λειτουργική γονιδιωματική, προσπαθούμε να χρησιμοποιήσουμε τις τρέχουσες γνώσεις μας για τη λειτουργία των γονιδίων για να αναπτύξουμε ένα μοντέλο που συνδέει τον γονότυπο με τον φαινότυπο (Εικ. 2) [16, 17].
Ο όρος λειτουργική γονιδιωματική χρησιμοποιείται συχνά προκειμένου να αναφερθούμε στις πολλές τεχνικές προσεγγίσεις για να μελετήσουμε τα γονίδια και τις πρωτεΐνες ενός οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των «βιοχημικών, κυτταρικών, ή/και φυσιολογικών ιδιοτήτων κάθε προϊόντος των γονιδίων.
Η λειτουργική γονιδιωματική μπορεί επίσης να περιλαμβάνει μελέτες φυσικής γενετικής παραλλαγής με την πάροδο του χρόνου (όπως η ανάπτυξη ενός οργανισμού) ή χώρου (όπως οι περιοχές του σώματός του), καθώς και λειτουργικές διαταραχές όπως επιδράσεις από το οξειδωτικό στρες, το περιβάλλον, τις μεταλλάξεις (SNPs) ή τις επιγενετικές διαφοροποιήσεις [16, 17].
Εικόνα 2. Γονιδιακό δίκτυο ρύθμισης οξειδοαναγωγής, που εξασφαλίζει την προσαρμογή του οργανισμού στο περιβάλλον
Εικ. 2 Γονιδιακό δίκτυο ρύθμισης οξειδοαναγωγής, που εξασφαλίζει την προσαρμογή του οργανισμού στο οξειδωτικό στρες και στο περιβάλλον, και ενσωματώνει τοπικά γονιδιακά δίκτυα μέσω βασικών μεταγραφικών παραγόντων [16, 17].
Ο στόχος της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι να παράγει και να συνθέτει την γονιδιωματική, την βιοχημική γενετική – μεταβολομική και την πρωτεομική γνώση σε μια κατανόηση των δυναμικών ιδιοτήτων ενός οργανισμού.
Αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να παρέχει μια πληρέστερη εικόνα του τρόπου με τον οποίο το γονιδίωμα καθορίζει τη λειτουργία σε σύγκριση με τις μελέτες των μεμονωμένων γονιδίων. Η ενσωμάτωση των λειτουργικών δεδομένων γονιδιωματικής είναι συχνά μέρος των προσεγγίσεων της βιολογίας των συστημάτων.
Το τελευταίο περιλαμβάνει μια σειρά από “-omics”, όπως transcriptomics (έκφραση γονιδίων), πρωτεομική (παραγωγή πρωτεΐνης), και metabolomics (παραγωγή μεταβολιτών των κυτταρικών βιοχημικών διαδικασιών) (Εικόνα 3) [18].
Εικόνα 3 Η ιεραρχία των τοπικών γονιδιακών δικτύων
Εικ. 3 Η ιεραρχία των τοπικών γονιδιακών δικτύων που ελέγχουν τις μεμονωμένες λειτουργίες σε ένα ενιαίο γονιδιακό δίκτυο του οργανισμού [18].
Η λειτουργική γονιδιωματική χρησιμοποιεί πολύπλοκες τεχνικές για τη μέτρηση της αφθονίας πολλών ή όλων των γονιδιακών προϊόντων, όπως mRNAs, των πρωτεϊνών, ή των μεταβολιτών μέσα σε ένα βιολογικό δείγμα.
Μια πιο εστιασμένη λειτουργική προσέγγιση γονιδιωματικής θα μπορούσε να δοκιμάσει τη λειτουργία όλων των παραλλαγών ενός γονιδίου και να ποσοτικοποιήσει τα αποτελέσματα των διαφοροποιήσεων κατά επίπεδο ελέγχου ή/και λειτουργικότητας (Εικόνα 1) χρησιμοποιώντας την εκάστοτε αλληλουχία αποτελέσματος ως ένδειξη της δραστηριότητας [1-6].
Αυτές οι λεπτομέρειες μέτρησης προσπαθούν να ποσοτικοποιήσουν τις διάφορες βιολογικές διεργασίες και να βελτιώσουν την κατανόησή μας για τις λειτουργίες και τις αλληλεπιδράσεις γονιδίων και πρωτεϊνών που τελικά διαμορφώνουν τον εκάστοτε κυτταρικό φαινότυπο.
Μαζί, με όλα τα παραπάνω η λειτουργική γονιδιωματική που περιγράφει τα αντίγραφα, τις πρωτεΐνες και τους μεταβολίτες ενός βιολογικού συστήματος, η ενσωμάτωση αυτών των δεδομένων παρέχει ένα πλήρες μοντέλο του υπό μελέτη βιολογικού συστήματος [19].
- Συγκριτική Γονιδιωματική – UTH e-Class, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&ved=2ahUKEwi97efLxKDuAhV7wAIHHQS7BbAQFjAAegQIAhAC&url=https%3A%2F%2Feclass.uth.gr%2Fmodules%2Fdocument%2Ffile.php%2FDIB_U_191%2FComparative_Genomics.pdf&usg=AOvVaw0Haz5nVWbR7tzrhnicjTE0
- An Introduction to Functional Genomics and Systems Biology, Evelien M. Bunnik and Karine G. Le Roch, ADVANCES IN WOUND CARE, VOLUME 2, NUMBER 9, DOI: 10.1089/wound.2012.0379.
- Functional genetics, Giovanna Marchetti, Mirko Pinotti, Barbara Lunghi, Caterina Casari, Francesco Bernardi, Mini Review, Thrombosis Research 129 (2012) 336–340, doi:10.1016/j.thromres.2011.10.028.
- Studying human and nonhuman primate evolutionary biology with powerful in vitro and in vivo functional genomics tools, Kathleen E. Grogan and George H. Perry, Evolutionary Anthropology. 2020;1–16, DOI: 10.1002/evan.21825.
- Functional Genomics, Shalini Kaushik, Sandeep Kaushik and Deepak Sharma, Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology 2018, doi:10.1016/B978-0-12-809633-8.20222-7.
- EMBL-EBI, https://www.ebi.ac.uk/training
- Baranov V, Baranova E, Ivashchenko T, Aseev M. The human genome and the genes of “predisposition”: an introduction to predictive medicine. SPb .: Inter-medika; 2000; p. 263.
- Baranov V. Molecular medicine – the basis of gene therapy. 2000; Vol. 34 (4): pp. 684–695.
- Baranov V. The program “Human Genome” as a scientific basis for preventive medicine. Vestn. RAMS; 2000; № 10: pp. 27–37.
- Kukes V. Metabolism of drugs: clinical and pharmacological aspects. Moskow: Refarm Publishing House; 2004; p.144.
- Sychev D. Clinical pharmacogenetics. Moskow: GEOTAR-Media; 2007; p. 245.
- Constans A. Making Medicine Personal.The Scientist; 2005; Vol. 16 (19): pp. 7–14.
- Nebert D. Ecogenetics: from biology to health. Toxicol. Indust. Hlth.; 1997; Vol. 13: pp. 163–192.
- Altman R. Challenges for biomedical informatics and pharmacogenomics. Ann. Rev. Toxicol. Pharmacol; 2001; Vol. 42: pp. 113–133.
- Evans W. Pharmacogenomics: the inherited basis for individual differences in drug response. Ann. Rev. in Genet. Human Genomics; 2001; Vol. 2: pp. 9–39.
- Kolchanov N, Podkolodnaya O, Ignatieva E. Integration of gene networks that con-trol the physiological functions of the body. VOGIS Bulletin; 2005; Vol. 9 (2); pp. 179–199
- Stepanenko I. Regulation of gene networks of the stress response by active forms of oxygen. Ekol. genetics.; 2004; Vol 2 (1): pp. 4–12.
- Kolchanov N, Ananko E, Kolpakov F. [et.al.] Gene networks. Molecular Biology. 2000: Vol. 34 (4): pp. 617–629.
- Pharmacometabolomics-aided Pharmacogenomics in Autoimmune Disease, Theodora Katsila, Evangelia Konstantinou, Ioanna Lavda, Harilaos Malakis, Ioanna Papantoni, Lamprini Skondra, George P. Patrinos, EBioMedicine 5 (2016) 40–45, DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2016.02.001.
B. Τι είναι η Μεταβολομική Ανάλυση;
Ο μεταβολισμός είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με την υγεία και με τις ανθρώπινες ασθένειες.
Η υψηλής ποιότητας αναπαράσταση του μεταβολισμού σε κλίμακα γονιδιώματος, δηλαδή με τρόπο που καταγράφει την αλληλεπίδραση μεταξύ των μεταβολιτών, είναι για τη συστημική βιολογία το κλειδί για την κατανόηση όλου του δίκτυου των μεταβολικών αντιδράσεων που παρουσιάζει ένας οργανισμός.
Η μεταβολομική αντιπροσωπεύει την επαναστατική προσέγγιση στην έρευνα, μιας και εστιάζει πέρα από τα απλά μονοπάτια, στην ολιστική διερεύνηση που προσπαθεί να αποτυπώσει την πολυπλοκότητα των μεταβολικών δικτύων.
Ακούμε συχνά για το μεταβολισμό και τη σημασία του για την υγεία μας, όμως πόσο γνωρίζουμε πραγματικά ποια είναι αυτή η σημασία;
Αν θέλουμε να δώσουμε έναν ορισμό του μεταβολισμού, θα πρέπει να ξεκινήσουμε από το κύτταρο. Το κύτταρο είναι ένα πολύπλοκο βιολογικό σύστημα, που αποτελείται από διάφορα υποσυστήματα τα οποία ονομάζουμε οργανίδια. Η λειτουργία του κυττάρου βασίζεται σε χημικές αντιδράσεις τις οποίες ονομάζουμε κυτταρική βιοχημεία. Αυτές λαμβάνουν χώρα σε όλα τα σημεία του κυττάρου, είτε στο κυτταρόπλασμα είτε στον πυρήνα, και συνθέτουν τη διαδικασία που ονομάζουμε μεταβολισμό (Εικόνα 1, καταβολισμός και αναβολισμός).
Εικόνα 1. Χάρτης των μέχρι σήμερα γνωστών μεταβολικών μονοπατιών στο ανθρώπινο κύτταρο καταδεικνύοντας παράλληλα την πολυπλοκότητα των χημικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα μέσα στο κύτταρο για μορφοποίηση των μεταβολιτών (Harvard Health Magazine, May – June 2011).
Γιατί, όμως, έχει τόση σημασία ο μεταβολισμός; Επειδή η κατανόηση του μεταβολισμού είναι θεμελιώδης για την κατανόηση της φαινοτυπικής συμπεριφοράς (δηλαδή των μορφολογικών, παραγωγικών, ηθολογικών κ.λπ. χαρακτηριστικών) όλων των ζωντανών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων και των ανθρώπων, όπου ο μεταβολισμός είναι άρρηκτα συνδεμένος με την υγεία και με τις ανθρώπινες ασθένειες.
Η υψηλής ποιότητας αναπαράσταση του μεταβολισμού σε κλίμακα γονιδιώματος, δηλαδή με τρόπο που καταγράφει την αλληλεπίδραση μεταξύ των μεταβολιτών, είναι για τη συστημική βιολογία το κλειδί για την κατανόηση όλου του δίκτυου των μεταβολικών αντιδράσεων που παρουσιάζει ένας οργανισμός. Οι αντιδράσεις αυτές διακρίνονται στις καταβολικές, που αφορούν τη διάσπαση πολύπλοκων ουσιών σε απλούστερες με παράλληλη, συνήθως, απόδοση ενέργειας (εξώθερμες) και στις αναβολικές, που αφορούν τη σύνθεση πολύπλοκων χημικών ουσιών, για την πραγματοποίηση των οποίων καταναλώνεται συνήθως ενέργεια (ενδόθερμες). Για να το πετύχει αυτό το κάθε κύτταρο λειτουργεί με την κατάλυση και τους συμπαράγοντες, που είναι μεταβολίτες, οι οποίοι μορφοποιούνται κατά τη διαδικασία του καταβολισμού και του αναβολισμού.
Η καταλυτική δραστικότητα πολλών ενζύμων εξαρτάται από την παρουσία μικρών µορίων που ονομάζονται συµπαράγοντες, αν και ο ακριβής ρόλος ποικίλλει, ανάλογα µε τον συµπαράγοντα και το ένζυμο. Ένα ένζυμο χωρίς τον συµπαράγοντά του καλείται αποένζυµο. Το πλήρως καταλυτικά ενεργό ένζυμο καλείται ολοένζυµο.
Οι συµπαράγοντες μπορούν να υποδιαιρεθούν σε δύο κατηγορίες: μέταλλα και μικρά οργανικά µόρια.
Οι «ομικές»
O επιστημονικός όρος «ομική» αναφέρεται σε μια ομάδα αναλυτικών μεθοδολογιών που σκοπό έχουν να χαρακτηρίσουν και να ποσοτικοποιήσουν τα βιολογικά μόρια. Αυτά είναι τα γονίδια (DNA), οι διάφορες μορφές του RNA (που καλούνται μετάγραφα), οι πρωτεΐνες και οι μεταβολίτες. Ο συνδυασμός όλων των παραπάνω μεταφράζονται και δίνουν τη δομή, τη λειτουργία και τη δυναμική των κυττάρων, ιστών ή οργανισμών.
Η γενομική, για παράδειγμα, περιγράφεται ως η ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του DNA. Αντίστοιχα η πρωτεομική περιλαμβάνει τη συστηματική μελέτη των πρωτεϊνών ώστε να διερευνηθούν η δομή, η λειτουργία και η ρύθμιση βιολογικών συστημάτων.
Η μεταβολομική
Η μεταβολομική αντιπροσωπεύει την επαναστατική προσέγγιση στην έρευνα, μιας και εστιάζει πέρα από τα απλά μονοπάτια, στην ολιστική διερεύνηση που προσπαθεί να αποτυπώσει την πολυπλοκότητα των μεταβολικών δικτύων.
Από την γονιδιακή έκφραση στον φαινότυπο: Τι πληροφορίες μας δίνουν οι «ομικές» και πώς αλληλοεπιδρούν μεταξύ τους.
Πιο συγκεκριμένα, η μεταβολομική είναι η μελέτη του μεταβολικού προφίλ μικρών μορίων μέσα σε έναν βιολογικό οργανισμό. Με τον όρο metabolome ορίζεται ολόκληρο το σετ των μεταβολιτών που υπάρχουν σε ένα κύτταρο, ιστό, όργανο ή οργανισμό και αντιπροσωπεύει όλα τα τελικά προϊόντα των κυτταρικών διεργασιών.
Δηλαδή η μεταβολομική παρέχει μια λειτουργική ματιά ενός οργανισμού, όπως αυτή καθορίζεται από το σύνολο των γονιδίων του, του RNA του, των πρωτεϊνών του και των περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως π.χ. η διατροφή, και οι φαρμακευτικές αγωγές. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται κατά κόρον από τη συστημική βιολογία ως εργαλείο για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων.
Η ανάλυση αυτή, στοχεύει στο να αποκαλύψει πώς επάρκειες και ανεπάρκειες σε μικροθρεπτικά συστατικά μπορούν να επηρεάσουν πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, οδηγώντας σε διατήρηση της υγείας ή σε εξέλιξη μιας ασθένειας.
Η παρουσίαση αυτής της γνώσης ως δίκτυο είναι το κλειδί για την κατανόηση των πολλαπλών και ευρέων αλληλεπιδράσεων μεταξύ συμπαραγόντων και πρωτεϊνών. Οι σχέσεις μεταξύ αλληλοεπιδρώντων συμπαραγόντων και πρωτεϊνών (και κατ’ επέκταση των γονιδίων) και των ασθενειών μπορεί να παρέχει στρατηγικές για την στοχευμένη διατροφική παρέμβαση σε διάφορους φαινοτύπους.
Δίκτυο συμπαραγόντων-ασθενειών
Μία ματιά στο παρακάτω σχήμα (Εικόνα 3) πιθανότατα προκαλεί σύγχυση σε κάποιον που δεν είναι ειδικός. Ωστόσο, η εικόνα αυτή, που θυμίζει μπερδεμένο κουβάρι, είναι απολύτως αντιπροσωπευτική της δουλειάς που κάνει η μεταβολομική! Προσπαθεί να ξεμπλέξει το «κουβάρι», που είναι η σύνδεση των συμπαραγόντων με τις διάφορες ασθένειες και πιάνοντας την… άκρη του νήματος, να οδηγήσει στη θεραπεία των ασθενειών.
Εικόνα 3. Οι συμπαράγοντες (που στην εικόνα εμφανίζονται ως οι κύκλοι στη δεξιά και την αριστερή πλευρά) συνδέονται με μια GWAS (genome wide association study) ασθένεια (τα τετράγωνα στο κέντρο της εικόνας), εάν η πρωτεΐνη που σχετίζεται με τη δεδομένη ασθένεια αλληλεπιδρά με τους συμπαράγοντες-στόχους. Οι ασθένειες είναι κωδικοποιημένες χρωματικά ανάλογα με το ποσοστό των GWAS πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τους συμπαράγοντες και έχουν ιεραρχηθεί ανάλογα με την συνάφειά τους (αύξουσα σειρά από την κορυφή προς τη βάση). Οι άκρες είναι σταθμισμένες ανάλογα με τον αριθμό των GWAS πρωτεϊνών που χρειάζονται τον συγκεκριμένο συμπαράγοντα.
Είναι σημαντικό να σημειώσουμε ότι σε πολλούς τύπους ιστών εκφράζονται πολύ περισσότεροι αλληλοεπιδρώντες συμπαράγοντες πρωτεϊνών παρά πρωτεΐνες. Πρωτεΐνες που αλληλοεπιδρούν με συγκεκριμένους παράγοντες, κυρίως οργανικές βιταμίνες, τείνουν να συν-εκφράζονται σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς, που θα μπορούσε να οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ελέγχονται από όμοιο σύστημα διαδικασιών απορρόφησης, διανομής, μεταβολισμού και απέκκρισης